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Para-infectious brain injury in COVID-19 persists at follow-up despite attenuated cytokine and autoantibody responses
為了瞭解COVID-19的神經併發症，此研究對203名COVID-19住院患者進行了腦損傷標記、發炎介質和自體免疫抗體的測量
- 與對照組相比，COVID-19感染者在急性期神經損傷的相關標記包括tTau、GFAP、NfL和UCH-L1都顯著升高，且在有神經併發症的患者中NfL和GFAP更高。
- COVID-19急性感染期時與發炎相關的介質IL-6、IL-12p40、HGF、M-CSF、CCL2和IL-1RA升高且與神經損傷標記的升高有相關性。
- COVID-19感染也會引發自體免疫抗體（包括對MYL7、UCH-L1和GRIN3B的抗體）的產生，尤其是在意識改變的患者。
- 恢復期時有神經併發症的患者神經損傷的相關標記GFAP和NfL仍持續升高，此時發炎和自體抗體相關的指數都已下降。
- 無論有沒有神經症狀，COVID的感染都會造成腦損傷標記的增加，而且此種腦損傷的跡象一直持續到早期恢復期，但有神經併發症者，此種腦損傷標記的增加會一直持續到6週以上。
Para-infectious brain injury in COVID-19 persists at follow-up despite attenuated cytokine and autoantibody responses
COVID-19相關的腦損傷在追蹤中持續存在，即便是細胞因子和自體抗體反應已減弱
文獻出處
背景
- COVID-19的神經併發症：在COVID-19大流行初期，相當比例的住院患者出現神經併發症，甚至包括輕症感染者。這些併發症通常輕微（如頭痛和肌肉痛），但也觀察有些病人出現到更嚴重的神經後遺症，包括腦炎/腦病變、Guillain Barre Syndrome、癲癇發作和中風。
- SARS-CoV-2間接神經影響：
- 病理研究顯示腦內病毒指數通常不高，直接由病毒入侵大腦造成造成神經功能障礙的可能性不高
- 腦脊液中很少發現病毒和/或抗病毒抗體。
- 病毒對大腦的間接影響機制：可能通過周邊產生的發炎介質、免疫細胞、自體抗體和/或與內皮損傷相關的血腦屏障改變間接影響大腦。
- 免疫反應與神經併發症：血清和腦脊液中IL-6水平的升高與神經併發症相關，包括腦膜炎、血栓、中風、認知和記憶障礙。
- 腦損傷標記與發炎反應的關聯：腦損傷標記NfL和GFAP以及發炎細胞因子在COVID-19中升高並與疾病嚴重程度相關。
- 自體免疫反應的可能性：一些COVID-19合併神經症狀的患者體內發現特定的神經細胞自體抗體。
研究目的
- 目的： 為評估免疫反應與腦損傷標記及神經損傷之間的關係，此研究結合了兩個大型多中心的研究族群，提供了COVID-19陽性患者的急性期、早期和晚期恢復期的血清。
生物標記物：腦損傷標記、細胞因子、發炎介質，以及自體抗體。
關聯性分析： 急性期意識狀況，神經症狀與各項生物標記的相關性分析。
研究方法
研究族群
- 此為一針對英國住院COVID-19患者的前瞻性研究
- 涵蓋英格蘭、威爾士和蘇格蘭（國家衛生研究院臨床研究網絡中央組合管理系統
- 健康對照組的：20-79歲的健康對照組參與者通過劍橋生物醫學研究中心招募（在COVID-19大流行前），他們未住院、未感染SARS-CoV-2，且無神經疾病。
- COVID-CNS研究的參與者：
收案期間： 2020年10月至2022年10月參與者或其親屬同意。
- 參與者招募方式：參與者在住院期間和出院後追溯性招募。
- 神經併發症定義：在急性SARS-CoV-2感染後6週內出現神經疾病，且無其他常見相關原因的證據。
- 研究分組：無神經併發症的COVID患者（COVID對照組）和有神經併發症的COVID患者（神經COVID病例）。
- 血清樣本收集時間：早期（COVID-19陽性測試後不到6週）或晚期恢復期（超過6週）時收集。樣本分裝、標記匿名標，並立即在-70°C下冷凍。
評估項目
腦損傷標記
- 使用的測量套件：Quanterix的Neurology 4-Plex B Advantage Kit。
- 測量的腦損傷標記：
神經絲蛋白輕鏈（ neurofilament light chain，NfL）:代表axonal and dendritic injury
泛素C端水解酶L1（Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1， UCH-L1）：代表neuronal cell body injury
總Tau蛋白（total-Tau ，tTau）：代表axonal and dendritic injury
膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）：代表astrocyte injury。
細胞發炎因子cytokine
- 檢測方法： 使用BioRad人類細胞因子篩選48-plex套件
- 樣本儲存和運輸變異的最小化措施：對每位參與者的濃度進行中位數中心化和標準化。
- 生成標準化數據集：先將發炎因子的pg/mL值進行對數轉換 ，從每個對數轉換值中減去對數轉換的中位數，以生成一組標準化數據。
- 自體抗體分析：
- 檢測方法： 使用HuProt™（版本4.0）平台的抗原蛋白質陣列來測量血清中結合的IgM和Ig
分析方法
- 圖形生成和統計分析軟體：Prism軟體（版本9.4.1，GraphPad Software Inc.）。
- 常態性檢驗：使用Shapiro-Wilk正態性檢驗來檢查數據分佈的正態性。
- 細胞發炎因子網絡分析：使用R軟體中的qgraph套件創建2D細胞因子網絡分析，並通過Steiger檢驗評估矩陣差異。
- 組間比較：通過Kruskal–Wallis檢驗進行組間比較。使用Fisher精確檢驗測量抗體的頻率差異。
結果
COVID-19導致血清腦損傷標記急性升高
- 參與者： 包括111名不同嚴重程度的COVID-19患者和60名未感染的健康對照組
- 時間：入院後1-11天
- GCS得分分層：依格拉斯哥昏迷量表GCS = 15或GCS ≤ 14分成按正常（n = 76）或異常（n = 35）作為神經功能障礙的
- 腦損傷標記：
- OVID-19感染者的NfL、GFAP和tTau血清水平顯著高於未感染的健康對照組
- GCS得分異常的參與者NfL和UCH-L1水平高於正常GCS得分的參與者：代表軸突和神經元細胞體損傷生物標記物能夠區分GCS降低與未降低的患者。
COVID-19中樞神經系統併發症患者的腦損傷標記持續升高
COVID-CNS的參與者：
- 92名COVID-19患者加入
- 56人為COVID-19合併急性神經併發症的：標記為“神經COVID”組
- 36人未出現此類神經併發症：標記為“COVID”組
神經COVID的持續維持較高的腦損傷標記持：
腦損傷標記較高：兩個COVID-19亞組（COVID和神經COVID）在所有時間點上均顯示NfL、GFAP和tTau（但不包括UCH-L1）血清濃度較控制組高。
神經COVID組持續較COVID組高：與COVID組相比，神經COVID恢復的參與者NfL顯著更高，且tTau稍高。
不同神經症狀下的NfL和tTau血清濃度：
NfL: 腦血管併發症者NfL血清濃度最高
tTau:在腦血管、中樞神經系統發炎和周邊神經併發症的者均升高。
早期和晚期恢復期的比較：
- 比較早期（入院後不到6週）和晚期恢復期（超過6週）
- 早期恢復期：所有COVID-19感杂者的NfL和GFAP仍然較高，
- 晚期恢復期： 只有在經歷過急性神經併發症的患者（神經COVID），NfL和GFAP在6週後仍然保持較高。
神經症狀和腦損傷標記與COVID-19急性期發炎介質相關：
- 發炎介質： 一共測量了血清中48種發炎介質。
- 升高的發炎介質：意識異常GCS<=14的感染者中六種介質顯著較高，（白介素[interleukin, IL]-6、肝細胞生長因子[hepatocyte growth facto, HGF]、IL-12p40、IL-1RA、CCL2和巨噬細胞集落刺激因子[macrophage colony stimulating factor, M-CSF]）。
- 發炎介質的相關性：這些發炎介質的濃度顯示有相互相關性，發炎介質的分類：第一群包括IL-1家族（包括IL-1RA）、干擾素和M-CSF，第二群包括IL-6、CCL2、CXCL9、HGF和IL-12p40。
- 腦損傷生物標記與發炎介質的相關性：GFAP和UCH-L1與第一群中的多種介質相關，而tTau和NfL與第二群中的HGF和IL-12p40有強烈相關性。
COVID-19後期恢復期發炎介質未升高, 但晚期tTau升高與數種發炎介質相關：
- 細胞和發炎相關介質在恢復期時下降：在恢復期時，即使是神經COVID-19神的患者中（標記為“神經COVID”），細胞因子和相關介質的濃度都比急性期時低。
- 發炎介質彼此之間的相關性降低：發炎相關介質之間的相關性不再顯示相同的緊密群聚。
- GFAP在神經COVID恢復期：GFAP在神經併發症的恢復期仍然較高，但與炎症介質沒有顯示相關性。
- NfL在神經COVID恢復期：NfL在有神經併發症的患者中整體較高，但與炎症介質沒有顯著相關性。
- tTau在神經COVID恢復期：tTau在有神經併發症的患者中整體保持升高，並與包括CCL2、IL-1RA、IL-2Rα和M-CSF以及CCL7、幹細胞因子（SCF）、IL-16和IL-18在內的八種發炎介質相關。
- 晚期特有的tTau和發炎介質相關性：這種關聯的表現特定於疾病的晚期階段，在急性COVID-19中未發現。
COVID-19神經併發症患者的發炎介質網絡顯著改變
- 發炎介質網絡的差異：急性期GCS 分數≤ 14的感染者和神經COVID患者均顯示出與無神經問題的COVID-19參與者不同的發炎因子網絡。
- 進一步的機轉路徑(pathway)分析：顯示COVID-19神經併發症患者的發炎網路有許多與其它發炎疾病了的共通點。
- JAK-STAT機轉路徑： COVID-19神經併發症患者血清顯示JAK-STAT為顯著影響的路徑。JAK-STAT路徑和细胞的生長、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的功能相關。
COVID-19與急性適應性免疫反應相關：
- 蛋白質微陣列的使用：使用153種病毒和組織蛋白質微陣列來測量急性期血清中的IgM和IgG反應。
- COVID感染後許多種抗原的抗體反應都較高：與對照組相比，無論是正常還是異常GCS得分的參與者之間大部分的IgG和IgM反應較高。
- COVID-19神經併發症患者特定自體抗體反應較單純COVID感染者高：中樞神經系統抗原UCH-L1、GRIN3B和DRD2以及心臟抗原肌球蛋白輕鏈（myosin light chain, MYL）-7的幾種IgM和IgG自體抗體，在GCS異常的參與者中比例更高，同樣對COVID棘蛋白的抗體也是如此。
- 抗體與腦損傷標記的相關性：這些抗體與腦損傷標記的葨度沒有顯著相關。
- 早期和晚期恢復期樣本中的自體抗體：早期和晚期恢復期樣本中血清IgM和IgG抗體的反應類似且IgM和IgG「命中」比對照組更頻繁（神經COVID組最高）。
- 在神經COVID較普遍發生的特定自體抗體：MYL7、促性腺激素釋放激素受體（GNRHR）和幾種HLA抗原的特定自體抗體反應在神經COVID參與者中較為普遍。
- 神經抗原抗體：
- 將急性期COVID-19患者的血清與大鼠腦切片、神經細胞，表達抗原的細胞孵育。對大鼠腦切片的結合確定了42/185（23%）的患者具有強烈的免疫組織化學染色，而且主要是與腦幹區域結合此外。
- 從34個選定樣本通過細胞的檢測來檢查特定自體抗體（LGI1、CASPR2、NMDAR、GABAB受體）的存在，只有一個與GABAB受體有細胞外的結合。
研究優勢和限制
優勢
- 研究了大量具有明確神經症狀和旳COVID患者。
- 檢測了多種不同的疫反應以及腦損傷標記。
限制性
- 缺乏長期追蹤的血液樣本： 急性，早期和晚期恢復期的血清是由不同人在不同時間所採集，大多數不是同一人的長期追蹤取得。
- 缺乏COVID-19嚴重程度評分：儘管沒有COVID-19嚴重程度評分，但我們知道患者是否需要氧氣；當在比較需要或不需要氧氣的患者時，6種細胞因子中有5種在異常GCS組中仍顯著升高。
- COVID-CNS研究的限制：在COVID-CNS研究中，儘管我們擁有詳細的臨床信息，但缺乏急性期血液樣本。
結論
腦損傷標記
- 急性期所有的腦損傷標記都增加：在急性期，所有四種腦損傷標記物（GFAP、NfL、tTau和UCH-L1）在患者中均較對照組升高。
- 意識改者特定的腦損傷標記增加： 特定的樹突和軸突損傷標記物（tTau和NfL）在GCS ≤ 14的參與者中顯著更高。
- 早期恢復期時的腦損傷標記：COVID感染者，無論是否有神經併發症，在早期恢復期（感染後<6週），GFAP、NfL和tTau仍然較對照組高。
- 晚期恢復期的腦損傷標記：然而在晚期時間點（>6週），只有急性期有神經併發症的患者，NfL和GFAP明顯較對照組高。
發炎反應
- COVID-19感染者發炎介質增加：與對照組相比，COVID患者顯示出多種發炎介質（IL-6、HGF、IL-12p40、IL-1RA、CCL2和M-CSF）增加。
- HGF和IL-12p40和意識改變相關：HGF和IL-12p40在意識改變與否的患者顯示出強烈的區分能力。
抗體反應
- 急性期IgG反應增加：急性期COVID-19患者對許多神經和非神經抗原都產生IgG抗體反應。
- 晚期恢復階段IgG反應的持續：這些增加的IgG反應持續到晚期階段，但針對抗原不同。
- 特定抗原的自體抗體反應：在意識有改變的患者，對特定抗原的自體抗體反應，包括神經抗原UCH-L1、GRIN3B和DRD2更常見。
- 晚期恢復階段的自體抗體反應：有無經歷COVID-19神經併發症的參與者可通過對HLA抗原的自體抗體存在與否來區分，而非神經抗原。
個人想法
- 這篇文章主要的結論應該是無論有沒有神經症狀，COVID的感染都會造成腦損傷標記的增加，而且此種腦損傷的跡象一直持續到早期恢復期，但有神經併發症者，此種腦損傷標記的增加會一直持續到6週以上晚期恢復期。
- 除了腦損傷之外，COVID的感染也誘發出許多和神經相關或不相關的抗體產生，可見COVID感染真的對許多組織都有潛在的影響力。
- 在急性感染期，發炎反應和腦損傷標記的增加相關，但到了晚期恢復期，相關性就不存了，有神經症狀者在發炎反應下降後，腦損傷的標記的濃度確仍明顯比對照組高，代表神經的損傷仍在繼續發展中，並未停止。所以long COVID的症狀中有很多都屬於神經相關的症狀，而且可能持續很久。
- 這篇文章摘要寫的還算清楚，但內文實在是對結果的交代不是很清楚，應該是檢測的項目太多，做太多分析，有許多結果放在補充資料中，又限於篇幅無法描述的太清楚，所以讀起來會有些辛苦。